Western免疫印跡(WesternBlot)是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過(guò)融合部分的抗體檢測(cè)。
Western Blot 免疫印跡法樣品制備主要步驟：
原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為 定性檢測(cè)目的蛋白時(shí)細(xì)胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。
1、培養(yǎng)細(xì)胞或藥物處理。
2、棄培養(yǎng)基，用1X PBS漂洗細(xì)胞2次，去盡殘留培養(yǎng)基。
3、加入1X SDS樣品緩沖液(6-well plate,100μl /w或 75 cm2 plate,500- 1000μl/瓶) ，刮落細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到Ep管。注意：冰上操作。
4、超聲 10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。
5、煮沸樣品5 minutes。
6、離心12000g，5 min，取上清。
7、電泳分離：上樣15μl~20μl 至 SDS-PAGE 膠 (10 cm x 10 cm)電泳。 如要定量檢測(cè)某蛋白的表達(dá)水平， 應(yīng)用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/100 mm dish/150cm2 flask)裂解細(xì)胞， 收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻4～15min，14000g離心15min(4℃)，棄沉淀，用Bradford法或其它蛋白質(zhì)測(cè)定方法測(cè)定上清中蛋白濃度以調(diào)整上樣體積和上樣量，進(jìn)行Western雜交時(shí)還需設(shè)置內(nèi)或外參照，通常用beta-actin。
注意：一般上樣20~30 μg已足夠，如待檢蛋白為低豐度蛋白，可加大上樣量 至100μg，但電泳條帶易拖尾，可制備亞細(xì)胞組份或采用更敏感的檢測(cè)方法。
注意事項(xiàng)：
1、操作中戴手套，不要用手觸膜。
2、PVDF膜在甲醇中浸泡時(shí)間不要超過(guò)5秒。
3、如檢測(cè)小于20kD的蛋白應(yīng)用0.2μm的膜，并可省略轉(zhuǎn)移時(shí)的平衡步驟。
4、某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫，此時(shí)可用1.0% BSA代替Tween-20。
5、關(guān)于封閉劑的選擇：5%脫脂奶/TBSor PBS: 能和某些抗原相互作用，掩蓋抗體結(jié)合能力；0.3~3% BSA in PBS：低的內(nèi)源性交叉反應(yīng)性。
6、如用0. 1% Tween20、0.02% NaN3 in PBSor TBS作封閉劑和抗體稀釋液，抗體檢測(cè)后可進(jìn)行蛋白染色。
7、如要同時(shí)檢測(cè)大分子量和小分子蛋白，*用梯度膠分離蛋白。
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